隨著國(guó)內(nèi)生物制藥行業(yè)的迅速發(fā)展，細(xì)胞灌注培養(yǎng)越來(lái)越受到人們關(guān)注，因?yàn)槠淇梢栽谳^小體積的生物反應(yīng)器中獲得高的細(xì)胞密度，其中細(xì)胞截留裝置是灌流培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)非常關(guān)鍵的一項(xiàng)，邁博瑞基于常年在過(guò)濾、分離及純化行業(yè)的積累，提出了利用深層過(guò)濾機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)灌流生物反應(yīng)袋過(guò)濾部件提出的挑戰(zhàn)，并成功開(kāi)發(fā)出Cellgard細(xì)胞截留板。

 

目錄

1.一次性生物反應(yīng)袋發(fā)展進(jìn)程 一次性生物反應(yīng)袋 帶過(guò)濾器的一次性生物反應(yīng)袋 一次性灌流生物反應(yīng)袋 2.一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求 3.一次性灌流生物反應(yīng)袋應(yīng)用及挑戰(zhàn) 一次性灌流生物反應(yīng)袋主要應(yīng)用 一次性灌流生物反應(yīng)袋在高細(xì)胞密度中面臨的挑戰(zhàn) 4.邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板 5.Cellgard細(xì)胞截留板性能實(shí)驗(yàn)分析 實(shí)驗(yàn)一：2L細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)二：50L細(xì)胞培養(yǎng) 6.邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板的優(yōu)勢(shì)

 

一、一次性生物反應(yīng)袋發(fā)展進(jìn)程

1、一次性生物反應(yīng)袋

1998年，Wave Biotech公司推出了Wave Bioreactor®搖擺式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用一次性生物反應(yīng)袋Cellbag®作為細(xì)胞及微生物培養(yǎng)容器。經(jīng)過(guò)市場(chǎng)多年的使用驗(yàn)證，一次性搖擺式生物反應(yīng)器系統(tǒng)及其所配套的耗材，已經(jīng)在全球范圍內(nèi)得到廣泛的接受與認(rèn)可。隨著生命科學(xué)及生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，行業(yè)主體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的要求越來(lái)越高，更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度、更短的培養(yǎng)周期、更低的培養(yǎng)成本、更高的培養(yǎng)成功率等。因此，一次性生物反應(yīng)器耗材制備技術(shù)、生物培養(yǎng)工藝等學(xué)科也在不斷發(fā)展，更新迭代。

圖1：®示意圖（圖片來(lái)自GE）

 

2、帶過(guò)濾器的一次性生物反應(yīng)袋

2001年，Dr. Vijay Singh發(fā)明了帶過(guò)濾器的一次性生物反應(yīng)袋產(chǎn)品，見(jiàn)圖2（專(zhuān)利號(hào)US6544788），該產(chǎn)品能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)，如細(xì)胞、微生物等，通過(guò)所述的“過(guò)濾器”截留在反應(yīng)袋內(nèi)部，同時(shí)將廢培養(yǎng)基液體通過(guò)“過(guò)濾器”排出反應(yīng)器外，并且實(shí)現(xiàn)新鮮培養(yǎng)基加入，從而實(shí)現(xiàn)了在Wave Bioreactor®及一次性反應(yīng)袋產(chǎn)品中連續(xù)化灌注培養(yǎng)細(xì)胞及微生物，為微生物培養(yǎng)工藝、生物制藥上游細(xì)胞擴(kuò)增工藝提供了有力的工具。

圖2：帶過(guò)濾器的一次性生物反應(yīng)袋示意圖（圖片來(lái)源：US6544788）

 

3、一次性灌流生物反應(yīng)袋

該技術(shù)發(fā)展到今天，最為行業(yè)所熟知的產(chǎn)品，即為Cytiva公司在售的XuriTM系列一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品，見(jiàn)圖3。隨著專(zhuān)利US6544788的到期，全球一次性耗材生產(chǎn)商也陸陸續(xù)續(xù)開(kāi)始了一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化工作。

圖3：XuriTM系列一次性灌流生物反應(yīng)袋產(chǎn)品（圖片來(lái)自Cytiva）

 

二、一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求

一次性灌流生物反應(yīng)袋的基本要求，是在產(chǎn)品使用者的生物培養(yǎng)工藝條件下，保證所培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞，達(dá)到預(yù)期的增殖密度，且在該過(guò)程中，起到截留作用的“過(guò)濾器”不堵塞，即液體能夠在較低的壓力下通過(guò)所述過(guò)濾裝置，同時(shí)，“過(guò)濾器”能夠有效截留被培養(yǎng)物質(zhì)，即過(guò)濾裝置下游幾乎無(wú)微生物或細(xì)胞穿透。因此，由上述可見(jiàn)，“過(guò)濾器”的截留性能是決定一次性灌流生物反應(yīng)袋能否滿(mǎn)足使用要求的關(guān)鍵核心部件。

 

三、一次性灌流生物反應(yīng)袋應(yīng)用及挑戰(zhàn)

1、一次性灌流生物反應(yīng)袋主要應(yīng)用

1. 一次性灌流生物反應(yīng)袋的一個(gè)重要應(yīng)用點(diǎn)，位于生物制藥工藝環(huán)節(jié)中的細(xì)胞擴(kuò)增工藝段。
2. 在細(xì)胞擴(kuò)增階段，使用者期望能夠通過(guò)灌流培養(yǎng)的工藝，實(shí)現(xiàn)對(duì)于CHO等工程細(xì)胞的高密度細(xì)胞培養(yǎng)。

高密度CHO細(xì)胞灌流培養(yǎng)的益處為：

• 一方面，可以提高細(xì)胞擴(kuò)增效率，甚至有可能減少1-2個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增工藝步驟，節(jié)省時(shí)間、原材料、金錢(qián)、人力成本，減少染菌風(fēng)險(xiǎn)，提高成功率
• 另一方面，在一些利用工程細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白、收獲病毒載體、獲得mRNA疫苗的小規(guī)模研產(chǎn)活動(dòng)中，高細(xì)胞培養(yǎng)密度能夠帶來(lái)更高的目標(biāo)物滴度，并提高效率

 

下圖4比較了一個(gè)用常規(guī)方法將細(xì)胞擴(kuò)大到500L生產(chǎn)用生物反應(yīng)器（n）中的例子，使用高密度細(xì)胞庫(kù)方法減少了中間兩個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的步驟，可以直接接種到2L的波浪生物反應(yīng)器中。使用波浪生物反應(yīng)器（2L和20L）代替轉(zhuǎn)瓶（125ml到10L）大大減少了需要在超凈臺(tái)中操作的次數(shù)。這種替換使整個(gè)過(guò)程在一個(gè)封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，提高了操作成功率。

圖4：常規(guī)與改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝過(guò)程比較（圖片來(lái)源：Bioprocess Int）

 

2、一次性灌流生物反應(yīng)袋在高細(xì)胞密度中面臨的挑戰(zhàn)

高細(xì)胞密度對(duì)于灌流生物反應(yīng)袋的挑戰(zhàn)是巨大的，尤其當(dāng)細(xì)胞密度上升后，對(duì)于過(guò)濾部件的壓力尤為明顯。

• 高細(xì)胞濃度時(shí)，過(guò)濾部件需要能夠維持灌流工藝的進(jìn)行，此即要求過(guò)濾部件面對(duì)高濃度料液挑戰(zhàn)時(shí)不被堵塞；
• 再者，被培養(yǎng)物，如細(xì)胞、微生物等由于本身結(jié)構(gòu)柔軟，在較低壓力驅(qū)動(dòng)下極容易穿透過(guò)濾介質(zhì)。
• 另外一個(gè)容易被忽視的地方，在于灌流生物反應(yīng)袋中的過(guò)濾部件在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中是隨著Wave Bioreactor®不斷“隨波逐流”的，長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)需求對(duì)過(guò)濾部件的機(jī)械可靠性能提出了更高的要求。

綜上，一款合格的適用于Wave Bioreactor®的截留過(guò)濾部件需要滿(mǎn)足高載量、長(zhǎng)壽命、高截留效率、高機(jī)械可靠性等要求。邁博瑞基于常年在過(guò)濾、分離及純化行業(yè)的積累，提出了利用深層過(guò)濾機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)灌流生物反應(yīng)袋過(guò)濾部件提出的挑戰(zhàn)，并成功開(kāi)發(fā)出Cellgard細(xì)胞截留板。

 

三、邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板

邁博瑞開(kāi)發(fā)的Cellgard細(xì)胞截留板是利用超高分子量聚乙烯粉末燒結(jié)工藝制成的一種深層過(guò)濾介質(zhì)，見(jiàn)圖5，有17×17cm和50×30cm兩種尺寸，厚度為3mm，見(jiàn)圖6。針對(duì)生物制藥行業(yè)對(duì)于工程細(xì)胞（如CHO DG44細(xì)胞，CHO K1細(xì)胞，HEK 293細(xì)胞等）擴(kuò)增培養(yǎng)的具體需求，Cellgard板材的孔徑被設(shè)計(jì)為7μm，同時(shí)，Cellgard高達(dá)300N/mm的穿刺強(qiáng)度，大大提高了截留部件的機(jī)械可靠性。這樣的設(shè)計(jì)，能夠良好的滿(mǎn)足灌流生物反應(yīng)袋對(duì)截留過(guò)濾部件提出的挑戰(zhàn)。在MS與客戶(hù)的灌流細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)測(cè)實(shí)驗(yàn)中，Cellgard細(xì)胞截留板均完美的實(shí)現(xiàn)了不同條件下的細(xì)胞培養(yǎng)并達(dá)到測(cè)試預(yù)期。

圖5：MS Cellgard細(xì)胞截留板

圖6：MS Cellgard細(xì)胞截留板尺寸示意圖

 

四、Cellgard細(xì)胞截留板性能實(shí)驗(yàn)分析

實(shí)驗(yàn)一：2L細(xì)胞培養(yǎng)

圖7：灌流式生物反應(yīng)袋結(jié)構(gòu)示意圖

 

在第一組測(cè)試中，尺寸為17×17cm2的Cellgard細(xì)胞截留板被制作成2L灌流式生物反應(yīng)袋（見(jiàn)上示意圖7）。該測(cè)試主要考察樣品灌流袋在未有蛋白表達(dá)情況下的細(xì)胞擴(kuò)增情況，所用細(xì)胞株為CHO K1。在設(shè)置的另外兩組平行實(shí)驗(yàn)中，同樣規(guī)格大小的兩個(gè)2L灌流反應(yīng)袋分別裝載標(biāo)稱(chēng)孔徑1微米的微濾膜及競(jìng)品細(xì)胞截留板作為灌流過(guò)濾部件。該測(cè)試約定，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞泄露、截留板堵塞、細(xì)胞活率下降至90%以下等情況時(shí)，停止實(shí)驗(yàn)。

在為期8天的培養(yǎng)過(guò)程中，裝配有Cellgard細(xì)胞截留板的反應(yīng)袋中的細(xì)胞濃度順利增殖到近120 M/ml的濃度，Day 7-8的培養(yǎng)中，跨膜壓差略微上升，細(xì)胞活率略下降，但是膜后收獲液未見(jiàn)細(xì)胞泄露，與平行對(duì)照組相比，同期細(xì)胞活率未見(jiàn)明顯區(qū)別，	裝載微濾膜的反應(yīng)袋Day 5出現(xiàn)嚴(yán)重的堵塞現(xiàn)象且下游伴隨約30%的細(xì)胞泄露，細(xì)胞活率較好，	裝載有競(jìng)品截留板的反應(yīng)袋Day 3出現(xiàn)細(xì)胞泄露，至Day 5時(shí)，泄露率達(dá)30%以上，細(xì)胞活率維持較好，
圖8：Cellgard 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、跨膜壓差、細(xì)胞泄露趨勢(shì)圖	圖9：微濾膜 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、跨膜壓差、細(xì)胞泄露趨勢(shì)圖	圖10：競(jìng)品截留板 2L WAVE 培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、跨膜壓差、細(xì)胞泄露趨勢(shì)圖

 

實(shí)驗(yàn)二：50L細(xì)胞培養(yǎng)

第二組測(cè)試主要考察被培養(yǎng)的細(xì)胞在表達(dá)蛋白的情況下，Cellgard截留板作為過(guò)濾部件的表現(xiàn)。所用Cellgard截留板尺寸為30×50cm2，反應(yīng)袋體積為50L。該培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的預(yù)設(shè)目標(biāo)，是利用灌流式生物反應(yīng)袋將CHO細(xì)胞培養(yǎng)至70 M/ml的細(xì)胞濃度，并至少維持5天以上，同時(shí)觀(guān)察蛋白表達(dá)及收獲液中的蛋白收率情況

本次培養(yǎng)起始階段細(xì)胞接種密度為0.3 M/ml，3天后細(xì)胞順利進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到Day 10時(shí)達(dá)到最高細(xì)胞密度84.7 M/ml。經(jīng)灌流速率、供養(yǎng)等參數(shù)調(diào)控后，培養(yǎng)密度順利維持在70 M/ml以上并保持較高的細(xì)胞活率，	同時(shí)，細(xì)胞蛋白表達(dá)亦進(jìn)入對(duì)應(yīng)的高峰期。經(jīng)測(cè)量反應(yīng)袋內(nèi)及截留板下游蛋白濃度，可得收獲端蛋白收獲率。Cellgard細(xì)胞截留板上下游幾乎無(wú)法測(cè)出蛋白濃度差，蛋白收獲率近100%，見(jiàn)圖12。該特性相較利用微濾膜、超濾膜技術(shù)實(shí)現(xiàn)灌流功能的器件相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。	灌流培養(yǎng)進(jìn)行至Day 18時(shí)，Cellgard細(xì)胞截留板下游開(kāi)始探測(cè)到有活細(xì)胞穿透，此時(shí)對(duì)應(yīng)的跨膜壓差增長(zhǎng)到50mbar。隨著灌流培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行，跨膜壓差繼續(xù)增長(zhǎng)，細(xì)胞穿透更加明顯，而細(xì)胞蛋白表達(dá)及下游收獲率幾乎不受影響，見(jiàn)圖13。細(xì)胞穿透的原因一般是由于跨膜壓差的驅(qū)動(dòng)使得細(xì)胞發(fā)生了形變而穿越了截留板的微孔結(jié)構(gòu)。我們建議用戶(hù)在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)控跨膜壓差，并根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)情況調(diào)整培養(yǎng)工藝。
圖11：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與細(xì)胞密度、細(xì)胞活率趨勢(shì)圖	圖12：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與mAB濃度、mAB收獲率趨勢(shì)圖	圖13：50L灌流袋細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)與跨膜壓力、收獲液細(xì)胞密度趨勢(shì)圖

 

至此，在兩種不同培養(yǎng)工藝條件下，Cellgard截留板均實(shí)現(xiàn)了高細(xì)胞培養(yǎng)密度、高截留率、長(zhǎng)使用壽命的目標(biāo)，培養(yǎng)情況均符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。Cellgard產(chǎn)品能夠?yàn)橐淮涡怨嗔魇缴锓磻?yīng)器的高密度細(xì)胞培養(yǎng)提供有力支撐。應(yīng)當(dāng)注意的是，由于用戶(hù)不同的培養(yǎng)工藝可能導(dǎo)致不同的培養(yǎng)結(jié)果，以上兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)僅供參考，不可視為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。 

 

五、邁博瑞Cellgard細(xì)胞截留板的優(yōu)勢(shì)

• 利用深層過(guò)濾機(jī)制，可實(shí)現(xiàn)更高密度的細(xì)胞培養(yǎng)，且抗堵塞能力強(qiáng)；
• 更高的機(jī)械強(qiáng)度，避免使用過(guò)程中出現(xiàn)因機(jī)械損傷導(dǎo)致的泄露；
• 特殊的孔徑設(shè)計(jì)，避免細(xì)胞泄露前提條件下，對(duì)蛋白等目標(biāo)產(chǎn)物幾乎無(wú)截留。

 

Cellgard細(xì)胞截留板產(chǎn)品現(xiàn)已開(kāi)放試用，歡迎新老客戶(hù)咨詢(xún)，產(chǎn)品尺寸可根據(jù)用戶(hù)需求進(jìn)行訂制，詳情請(qǐng)咨詢(xún)您身邊的MS銷(xiāo)售工程師。

 

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